KROMATOGRAFI, HPLC, GC, ELEKROFORESIS

KROMATOGRAFI, HPLC, GC, ELEKROFORESIS

Sekarang ini, kromatografi sangat diperlukan dalam kefarmasian dalam memisahkan suatu campuran senyawa. Dalam kromatografi, koponen-komponen terdistribusi dala dua fase. Salah satu fase adalah fase diam.
Transfer massa antara fase bergerak dan fase diam terjadi bila molekul-molekul campuran serap pada permukaan partikel-partikel atau terserap di dalam pori-pori partikel atau terbagi kedalam sejumlah cairan yang terikat pada permukaan atau didalam pori.
Kromatografi dibagi menjadi beberapa macam, dalam makalah ini akan dijelaskan beberapa keterangan tentang beberapa macam kroatografi, antara lain HPLC ( High Performance Liquid Chromatography), GC (Gas Chromatography) dan Elektroforesis.

HPLC
( High Performance Liquid Chromatography)

Dalam beberapa tahun ini teknologi HPLC dan pemakaiannya sangat berkembang da walaupun nisbi mahal, HPLC telah menjadi metode analisis rutin dan bahkan preparative pada banyak laboratorium.

Alat HPLC niaga terdiri atas system pencampur pelarut yang sangat canggih yang mampu menghasilkan campuran landaian yang mengandung sampai empat linarut yang berbeda, pompa yang mampu menghasilkan tekanan sampai 6000psi atau 10.000 psi, kolom yang mengandung fase diam (atau lebih tepat penyangga), dan system pendeteki sinambung yang bermacam-macam jenisnya. Yang paling sering ditemukan, seluruh radas itu dipimpin dan dikendalikan oleh mikroprosesor.

Kolom yang tersedia mempunyai banyak sekali pelat teori (lebih dari 100.000 untuk kolom 100cm), dan kromatografi dilakukan dalam kondisi yang mendekati kondisi ideal demikian rupa sehingga dapat diperoleh pemisahan yang sangat baik; seringkali, hasil dapat diperoleh dalam beberapa menit dan ditafsirkan secara kuantitatif dengan ketepatan yang lumayan. Cuplikan dapat dipisahkan secara preparative.

Sedikit banyak HPLC dan GC saling melengkapi. GC telah dilengkapi instrumen dan dikembangkan demikian rupa sehingga daya pisah yang tinggi dan hasil kuantitatif mudah diperoleh. Akan tetapi, GC mensyaratkan bahwa seyawa yang dipisahkan haruslah atsiri. HPLC mempunyai pembatas yang sebanding yaitu cuplikan harus larut didalam zat cair. Akan tetapi ini bukan pembatas yang berat., dan setidaknya HPLC dapat dipakai untuk sebagia besar senyawa tak atsiri dan senyawa berbobot molekul tinggi. Selain itu HPLC dapat dipakai untuk senyawa anorganik, yang sebagian besar tidak atsiri. HPLC biasanya dilakukan pada suhu kamar. Jadi, senyawa yang tidak tahan panas dapat diangani dengan mudah.

Pada metode kromatografi cair ini digunakan kolom tabung gelas denganberacam diameter.parikel dengan dimensi yang bervariasi digunakan sebagai penunjang stasioner. Banyaknya cairan pada kolom jumlahnya sedemikian rupa sehingga hanya cukup menghasilkan sedikit tekanan untuk memelihara aliran fase bergerak yang seragam. Secara keseluruhan pemisahan ini memakan waktu lama. Berbagai usaha telah dilakukan untuk menambah laju aliran tanpa mengubah tinggi piringan teoritis kolom.

Penurunan ukuran partikel penunjang stasioner tidak selalu menguntungkan. Kromatografi cair kinerja tinggi atau High Performance Liquid Chromatography (HPLC) berbeda dari kromatografi cair klasik. HPLC menggunakan kolom dengan diameter umumnya kecil, 2-8 mm dengan ukuran partikel penunjang ; sedangkan laju aliran dipertinggi dengan tekanan yang tinggi.

Prinsip HPLC
Luas puncak kromatografi pada kurva elusi dipengaruhi oleh tiga proses perpindahan massa yaitu difusi Eddy, difusi longitudinal dan transfer massa tidak setimbang. Sedangkanparameter-parameter yang menentukan proses berlangsungnya proses-prosess tersebut adalah : laju aliran, ukuran partikel, laju difusi dan ketebalan stasioner.

Penunjang
Penunjang fase diam harus tahan erhadap tekanan. Biasanya penunjang anorganik bersifat stabil dan tahan sampai tekanan 600 atm. Struktur dengan pori-pori yang besar akan rusak bila diberi tekanan tinggi. Penukar ion, mempunyai permeabilitas yang rendah bila diberi tekanan.

Penunjang yang baik adalah silica gel dan alumina. Penunjang dengan bahan kimia di permukaannya (bonded phase) mempunyai kelebihan karena tidak perlu dijenuhkan lagi permukaannya oleh fase cair dan idak memerlukan prekolom. Fase diam terikat secara kovalen dengan permukaan zat padat penunjang sehingga diharapkan tidak mudah lepas dan mengkontaminasi eluen.

Penunjang dengan kemampuan penukar ion pemakaiannya terbatas,karena mudah terkompresi,tetapi saat ini bermacam resin sintetis yang taha tekanan sampai 200 amosfer sudah dapat diperoleh. Resin demikian mempunyai kapasitas penukar ion antara 3 sampai 5 meq/g.

Penunjang fase diam untuk kromatografi eksklusi lebih rumit daripada resin penukar ion. Hamper semua ipe gel dalam kolom untuk jenis eksklusi tidak tahan tekanan. Penyusutan volume akan terjadi sehingga permeabilitasnya turun dan akibatnya efisiensi pemisahan menurun.

Pemakaian
HPLC dengan prinsip kromatografi adsorpsi banyak digunakan pada industri farmasi dan pestisida. Zat-zat dengan kepolaran berbeda, yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair. Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikan dengan kolom butiran berlapiskan zat berpori.

Penukar ion gel silica yang dimodifikasi secara kimia dan penukar ion klasik. Asam-asam nukleat telah terpisahkan pada PLB, waktu analisisnya lebih pendek. Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan pada resin Zipax-SAX. Penukar ion gel silica yang dimodifikasi secara kimia mempunyai kapsitas tukar tinggi, vitamin-vitamin yang larut dalam air misalkan telah dapat dipisahkan.

Pemakaian HPLC pada kromatografi eksklusi dilakukan dengan kolom panjang, tujuan utama kerjanya tetap sama yaitu penentuan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia. Pada umumnya teknik ini dapat digunakan pada setiap metode kolom kromatografi.

GC (Gas Chromatography )

Kromatografi Gas adalah metode kromatografi pertama yang dikembangkan pada jaman instrument dan elektronika yang telah merevolusikan keilmuan selama lebih dari 30 tahun. Sekarang GC dipakai secara rutin di sebagian besar laboratorium industri dan perguruan inggi. GC dapat dipakai untuk setiap campuran yang komponennya atau akan lebih baik lagi jika semua komponennya mempunyai tekanan uap yang berarti pada suhu yang dipakai untuk pemisahan.

Tekanan uap atau keatsirian memungkinkan komponen menguap danbergerak bersama-sama dengan fase gerak yang berupa gas. Pada kromatografi cair pembatasan yang bersesuaian ialah komponen cairan harus mempunyai kelarutan yang berarti didalam fase gerak yang berupa cairan. Secara sepintas tampaknya pembatasan tekanan uap pada

Kromatografi gas lebih serius daripada pembatasan kelarutan pada kromatografi cair, secara keseluruhan memang demikian. Akan tetapi, jika kita ingat bahwa suhu sampai 400¬0C dapat dipakai pada kromatografi gas dan bahwa kromatografi dilakukan secara cepat untuk meminimumkan penguraian, pembatasan itu menjadi tidak begitu perlu. Disamping itu, pada KG, senyawa yang tak atsiri sering dapat dibah menjadi turunan yang lebih atsiri dan lebih stabil sebelum kromatografi.

Dalam kromatografi gas, fase bergeraknya adalah gas dan zat terlarut terpisah sebagai uap. Pemisahan tercapai dengan partisi sampel antara fase gas bergerak dan fase diam berupa cairan dengan titik didih tinggi (tidak mudah menguap) yang terikat pada zat padat penunjangnya.

Ada beberapa kelebihan kromatografi gas, diantaranya kita dapat menggunakan kolom lebih panjang untuk menghasilkan efisiensi pemisahan yang tinggi. Gs dan uap mempunyai viskositas yang rendah, demikian juga kesetimbangan partisi antara gas dan cairan berlangsung cepat, sehingga analisis relative cepat dan sensitifitasnya tinggi. Fase gas dibandingkan sebagian besar fase cair tidak bersifat reaktif terhadap fase diam dan zat-zat terlarut. Kelemahannya adalah tehnik ini terbatas unruk zat yang mudah menguap.

Kromatografi gas merupakan metode yang tepat dan cepat untuk memisahkan campuran yang sangat rumit. Waktu yang dibutuhkan beragam, mulai dari beberapa detik utnuk campuran sederhana sampai berjam-jam untuk campuran yang mengandung 500-1000 komponen. Komponen campuran dapat diidentifikasikan dengan menggunakan waktu tambat (waktu retensi) yang khas pada kondisi yang tepat. Waktu tambat ialah waktu yang menunjukkan berapa lama suatu senyawa tertahan dalam kolom.waktu tambat diukur dari jejak pencatat pada kromatogram dan serupa dengan volumetambat dalam KCKT dan Rf dalam KLT. Dengan kalibrasi yang patut, banyaknya (kuantitas) komponen campuran dapat pula diukur secara teliti . kekurangan utama KG adalah bahwa ia tidak mudah dipakai untuk memisahkan campuran dalam jumlah besar. Pemisahan pada tingkat mg mudah dilakukan, pemisahan campuran pada tingkat g mungkin dilakukan; tetapi pemisahan dalam tingkat pon atau ton sukar dilakukan kecuali jika tidak ada metode lain.

Pada KG dan KCKT, kolom dapat dipakai kembali dan jika dirawat dengan baik dapat tahan lama. Perawatan harus dilakukan karena kolom dapat sangat mahal.

Fase diam pada KG biasanya berupa cairan yang disaputkan pada bahan penyangga padat yang lembab , bukan senyawa padat yang berfungsi sebagai permukaan yang menyerap (kromatografi gas-padat). Sistem gas-padat telah dipakai secara luas dalam pemurnian gas dan penghilangan asap, tetapi kurang kegunaannya dalam kromatografi. Pemakaian fase cair memungkinkan kita memilih dari sejumlah fase diam yang sangat beragam yang akan memisahkan hampir segala macam cmapuran.

Satu-satunya pembatas pada pemilihan cairan yang demikian ialah bahwa zat cair itu harus stabil dan tidak atsiri pada kondisi kromatografi. Akan tetapi, keadaan ini berubah akibat pengembangan fase terikat dan pemakaian kolo kapiler atau kolom tabung terbuka yang sangat efisien. Pada fase terikat, cairan sebenarnya terikat pada penyangga padat atau pada dinding koplom kapiler, tidak hanya disaputkan begitu saja.
Pemakaian detector untuk menganalisis efluen kromatograf secara sinambung telah memungkinkan adanya KG dan KCKT. Pada KG, tersedianya berbagai detector, pemakaiannya yang umum untuk banyak jenis senyawa, dan tingkat kepekaannya yang tinggi telah memungkinkan penentuan secara teliti berbagai jenis komponen dalam kisaran yang besar, kadang-kadang dalam jumlah yang sangat kecil. Tersedianya detector selektif, misalnya detector yang hanya mendeteksi senyawa yang mengandung P, N, atau S merupakan hal yang sangat penting pula. Ini berbeda dengan KCKT yang hanya menyediakan lebih sedikit jenis detector dan kurang peka.

Petunjuk cara kerja
Walaupun beberapa system KG sangat rumit, pada dasarnya cara kerjanya sama. Jika KG telah dinyalakan maka dapat dilakukan beberapa langkah berikut ini ;

1. istrumen diperiksa, terutama jika tidak dipakai terus-menerus. Ini dilakukan untuk mengecek apakah telah dipasang kolom yang tepat, apakah septum injector tidak rusak (apakah ada lubang besar atau bocor karena sering dipakai), apakah sambungan saluran gas kedap, apakah tutup tanur tertutup rapat, apakah semua bagian listrik bekerja dengan baik, dan apakah detector yang terpasang sesuai.

2. aliran gas kekolom dimulai atau disesuaikan. Ini dilakukan dengan membukan katup utama pada tangki gas dan kemudian memutar katup (diafragma) sekunder kesekitar 15psi dan membuka katup jarum sedikit. Ini memungkinkan aliran gas yang lambat (2-5 ml)/menit untuk kolom kemas dan sekitar 0,5ml/menit untuk kolom kapiler melewati system dan melindungi kolom dan detector terhadap perusakan secara oksidasi. Dalam banyak instrument modern, aliran gas dapat diatur dengan rotameter atau aliran otomatis atau pengendali tekanan, atau dapat dimasukkan melalui modul pengendali berlandas mikroprosesor. Apapun jenisnya, sambungan system (terutama sambungan kolom) harus dicek dengan larutan sabun untuk mengetahui apakah ada yang bocor, atau dengan larutan khusus untuk mendeteksi kebocoran (SNOOP),atau dapat juga dengan larutan pendeteksi kebocoran niaga.


3. kolom dipanaskan sampai suhu awal yang dikehendaki. Ini dilakukan, pada instrument buatan lama, dengan memutar transformator tegangan peubah yang mengendalikan gelungan pemanas dalam tanur kesekitar 90 V.


ELEKTROFORESIS

Definisi
Tehnik pemisahan komponen-komponen dengan pengaruh arus listrik sehingga terjadi laju perpindahan disebut sebagai suatu elektroforesis atau elektrokromatografi. Secara luas teknik ini diklasifikasikan dalam tiga kelompok yaitu elektroforesis free boundary, elektroforesis wilayah dan elektroforesis kontinyu.

Prinsip Elektroforesis
Jika suatu fase zat bermuatan, diberi beda potensial, fase tersebut akan berpindah sepanjang medium yang kontinyu kearah katoda atau anoda sesuai dengan muatan partikel. Fenomena ini adalah elektroforesis.

Dasar elektroforesis adalah pembentukan suatu ketidakhomogenan atau gradasi konsentrasi sepanjang system. Koloid, protein enzim menunjukkan mobilitas elektroforesis spesifik dan titik isoelektrik yang dapat digunakan untuk identifikasi zat-zat spesifik. Pemisahan dapat dilakukan bila senyawa-senyawa yang telah terpisah tidak secara spontan bercampur kembali akibat sirkulasi konvektif.

Keterbatasan elektroforesis free boundary dapat diatasi secara parsial dengan melakuka kromatografi pendahuluan sebelum proses elektroforesisnya sendiri. Inidilakukan dengan mencampurkan larutan buffer dan memvariasikan konsentrasi nonelektrolit yang larut, kemudian biarkan merayap vertical pada tabung elektroforesis yang akan digunakan, sehingga terbentuk gradient perbedaan kerapatan akibat gravitasi.

Di pihak lain bila perpindahan elektroforesis dilakukan pada suatu medium berpori, wilayah perpindahannya tidak dipengaruhi oleh gradient kerapatan dan temperature. Pada medium tersebut aliran cairan dalam tabung berbanding terbalik terhadap kuadrat dari jari-jari penampang melintang tabung. Kertas saring, agar, kanji, gelatin, butiran-butiran kaca umumnya digunakan karena memiliki rongga kapiler. Kertas penyaringlah yang palng sering digunakan karena pemisahan yang sempurna dapat dilakukan dan mudah dikelola. Pemisahan dapat dilakukan baik horizontal ataupun erikal dan interferensi anomaly paling kecil pada boundary.
Pada umumnya istilah elektrokromatografi digunakan untuk pemisahan berdasarka perbedaan transport fisik zatterlarut yang bermuatan di dalam medium kertas akibat pengaruh gradient potensial.

Perpindahan partikel bermuatan dalam kertas tergantung pada tanda dan besarnya muatan pada zat terlarut, permukaan, muatan, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kuat io, pH, temperatur, viskositas, adsortiitas zat terlarut dan sifat-sifat fisika kimia lainnya medium migrasi. Ion yang berpindah pada suatu arah juga mempengaruhi mobilitas ion-ion lain yang bergerak pada arah yang berlawanan.

Peralatan dan Metodologi
Secarik kertas saring dibasahi dengan suatu elektrolit dan direntangkan secara horizontal diantara dua ruang elektroda yang berbeda potensial. Sampel diletakkan ditengah-tengah lembaran kertas. Lembaran kertas diletakkan diantara dua lempeng kaca untuk mencegah penguapan elektrolit.

Arus searah digunakan pada beda teganan sekitar 100-300 volt, elektroda yang digunakan karbon dari platina. Kombinasi elektromatografi dengan aliran pelarut yang simultan untuk memisahkan zat-zat inik juga telah dikembangkan.

Elekroforesis Wilayah
Ada berbagai factor yang mempengaruhi laju perpindahan elektroforesis wilayah. Factor-faktor yang mempengaruhi pergerakan ion adalah mobilitas ion, tipe resolusinya, macam larutan buffernya, pH yang digunakan, kuat ion zat terlarut, temperature, ada atau tidaknya fenomena elektrolisis atau elektroosmosis.

Medium yang umum digunakan adalah kertas saring, selulosa, asetat, gel seperti kanji, poliakrilamida dan bubuk gel.

Elektroforesis Tirai (Elektroforesis Kontinyu)
Elektroforesis kontinyu yaitu suatu elektroforesis yang dilakukan secara kontinyu. Suatu tirai dari kertas saring digunakan yang mana terendam dalam larutan buffer. Suatu aplikator digunakan untuk meneteskan sampel. Sampel masuk dalam aplikator dari suatu reservoir sampel. Kedua ujung kertas saring dalam bentuk alur tercelup dalam dua ruang elektroda. Dengan pemberian tegangan, partikel zat terlarut mulai bergerak dan komponen terpisahkan dalam berbagai permukaan.

Pemakaian Analitik Elektrokromatografi
Homogenitas wilayah elektrokromatografi adalah suatu criteria penting untuk memperoleh kemurnian. Teknik elektrokromatografi pada kertas telah digunakan untuk pemisahan komponen-komponen yang sulit dipisahkan. Pemisahan anorganik segera dapat dil;akukan melalui agen pengompleks. Agen ini mempengaruhi laju kromatografi sedangkan kompleks elektromigrasi mempunyai afinitas adsorbsi yang berbeda terhadap medium migrasi serta berbagai bentukion sederhana misalkan Ag, Ni berpindah kearah katoda, tetapi dengan penambahan EDTA, Ni saja yang pindah ke anoda. Logam-logam alkali dan magnesium juga dipisahkan. Pemisahan Pb, Pt, Rh, Ir, Os, Ru, dan Au secara kuantitatif pada secarik kertas diperoleh dengan elektrokromatografi dalam berbagai larutan elektrolit.
Setelah kertas, medium lain yang tepat untuk percobaan elektromigrasi adalah kanji. Pemisahan pada umumnya dilaksanakan dalam kolom, dan kadangkala untuk sejumlah komponen mempunyai beberapa kelebihan disbanding dengan kertas. Teknik elektrokromatografi banyak digunakan pada pemisahan ion-ion anorganik dan diagnosis klinik.

Osmosis Terbalik
Teknik ini adalah teknik yang sedang berkembang. Diantara pemakaiannya adalah pengolahan air limbah. Biasanya air dibersihkan dengan mengeluarkan kotoran dari air,tetapi dengan cara ini justru air diperas keluardari limbah air. Limbah berupa air garam dimasukkan melalui bagian celah sel. Pada bagian bawah air garam akan tersekat oleh suatu membrane semipermeabel yang umumnya terbuat dari polistirena, cellophane polivinil klorida atau etil selulosa.

Air segar cenderung untuk bergerak melalui membrane semi permeable menuju bagian yang konsentrasi garamnya tinggi, tetapi dengan memberikan tekanan yang cukup tinggi pada bagian air garamnya, tekanan osmosis normalinya dapat dibalik, berarti aliran dan keluar pada saluran bagian bawah. Osmosis terbalik tidak mempunyai pemakaian analitik.


Elektrodialisis
Metode ini merupakan metode yang masih dapat dikembangkan, yang mana ion-ion positif dan negative dalam suatu aliran air rawa-rawa dipisahkan dengan melakukannya sepanjang membrane penukar ion dibawah pengaruh medan listrik.air rawa-rawa dimasukkan melalui tiga saluran pada bagian atas sel. Suatu medan listrik dengan kutub membuat ion positif dan ion negative bergeser pada arah yang berlawanan.

Dengan pemilihan membrane penukar ion yang tepat, maka dimungkinkan menjadikan membrane kation permeable terhadap kation dan penukar anion yang permeable terhadap anion. Dengan pengaturan kondisi aliran, air yang keluar sebagai efluen pada penyalur bagian tengah akan mengandung garam yang lebih rendah disbanding kedua penyalur lainnya.teknik ini sebenarnya dasar pengembangan tekik osmosis terbalik.

DAFTAR PUSTAKA

Anonim, 1995, Farmakope Indonesia.Edisi IV.hal. 102. DepKes RI. Jakarta

Gritter, dkk., 1991, Pengantar Kromatografi. Hal.34-35,186. ITB Press.
Bandung

Khopkar, S.M. 1990. Konsep Dasar Kimia Analitik. Hal.160,166, 167-168. UI
Press. Jakarta

Mulja, Muhammad & Suharman, 1995, Analisis Instrumental. Hal 150.
Airlangga University Press. Surabaya